中大新聞網(wǎng)訊（通訊員夏煒）蛋白質(zhì)的磷酸化是一種由激酶和磷酸酶介導(dǎo)的可逆蛋白質(zhì)翻譯后修飾（Protein translational modification, PTM）過程。這一動(dòng)態(tài)修飾過程在新陳代謝、轉(zhuǎn)錄、分化以及細(xì)胞間通訊等細(xì)胞生命的幾乎所有方面都發(fā)揮著重要作用。蛋白激酶在這種調(diào)控機(jī)制中扮演著核心角色，它們催化ATP的γ-磷酸向蛋白質(zhì)底物的氨基酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)移，從而實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵的磷酸化過程。在眾多蛋白激酶當(dāng)中，McsB是革蘭氏陽(yáng)性菌中目前已知的唯一一種精氨酸磷酸化激酶。其主要參與了細(xì)菌蛋白質(zhì)功能和穩(wěn)定性的動(dòng)態(tài)調(diào)控。在熱應(yīng)激條件下，McsB與激活蛋白McsA結(jié)合后能夠有效磷酸化熱休克轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CtsR，CtsR的磷酸化修飾是解除其對(duì)clpC啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄抑制的關(guān)鍵步驟，這一修飾激活了蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)核心組件的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而降解細(xì)菌中因熱應(yīng)激產(chǎn)生的變性蛋白質(zhì)。在這一過程中，金屬蛋白McsA能夠結(jié)合McsB，增強(qiáng)其激酶活性，這一事實(shí)已經(jīng)被廣泛報(bào)道，但有關(guān)McsA-McsB復(fù)合物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)以及McsA如何激活McsB使底物CtsR發(fā)生磷酸化動(dòng)態(tài)修飾的分子機(jī)制仍然未知。解析McsA激活McsB的分子機(jī)制，有助于深入研究細(xì)菌在熱壓力下如何利用磷酸化動(dòng)態(tài)修飾維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，并基于此開發(fā)針對(duì)性的干預(yù)藥物，將為抗菌治療提供新的思路和理論依據(jù)。
近日，中山大學(xué)的毛宗萬(wàn)教授、夏煒教授和四川大學(xué)華西醫(yī)院的蘇昭銘教授合作，首次報(bào)道了金黃色葡萄球菌的McsA-McsB復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示McsB的四個(gè)亞基占據(jù)中心位置，形成一個(gè)夾層二聚體。兩個(gè)二聚體之間有 30°的旋轉(zhuǎn)角，暴露出激酶的活性位點(diǎn)。每個(gè)McsA亞基位于復(fù)合物的四個(gè)遠(yuǎn)端分別利用一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域及兩個(gè)α螺旋與一個(gè)McsB單體相互作用，從而形成4 McsA-4 McsB的復(fù)合物形式。若破壞該鋅指結(jié)構(gòu)域，則McsA無(wú)法結(jié)合McsB，進(jìn)而無(wú)法激活McsB。揭示了鋅離子在維持McsA正常結(jié)構(gòu)及其與McsB相互作用中的重要作用。
觀察McsB與McsA的相互作用面可知，McsB通過一段長(zhǎng)環(huán)區(qū)與McsA的鋅指結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)α螺旋完成相互作用。在單獨(dú)的McsB中，McsB長(zhǎng)環(huán)區(qū)主要通過兩個(gè)酪氨酸殘基Y147和Y153形成典型的T型π-π堆積，以保持穩(wěn)定。值得注意的是，催化殘基之一的C157位于同一環(huán)區(qū)。若破壞該π-π堆積，則會(huì)擾亂催化殘基C157的朝向，最終導(dǎo)致McsB完全喪失激酶活性。由于McsB長(zhǎng)環(huán)區(qū)的構(gòu)象對(duì)其激酶活性的關(guān)鍵作用，研究者推測(cè)McsA結(jié)合可能會(huì)穩(wěn)定該環(huán)區(qū)，從而固定催化殘基C157的朝向，進(jìn)而加強(qiáng)McsB對(duì)CtsR的磷酸化修飾活性。為了驗(yàn)證假設(shè)，研究者對(duì)McsB和McsA-McsB復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)（Molecular Dynamics，MD）模擬。RMSF分析表明，與McsA-McsB復(fù)合物結(jié)構(gòu)相比，McsB的一個(gè)區(qū)域（殘基I145-G164）的柔性大大增強(qiáng)。這一柔性區(qū)域包括McsB長(zhǎng)環(huán)區(qū)域（殘基Y147-L154）和關(guān)鍵的催化殘基（Cys157）。這些發(fā)現(xiàn)揭示了McsA在穩(wěn)定和限制McsB長(zhǎng)環(huán)區(qū)和保守催化Cys殘基的動(dòng)態(tài)行為中的關(guān)鍵作用。
此外，結(jié)構(gòu)信息顯示McsA的結(jié)合位點(diǎn)接近McsB的底物結(jié)合口袋，表明McsA可能會(huì)干擾McsB和底物CtsR之間的相互作用。研究者通過微量熱涌動(dòng)（Microscale Thermophoresis，MST）和生物層干涉（Bio-Layer Interferometry，BLI）等實(shí)驗(yàn)表明，McsA的結(jié)合會(huì)降低McsB對(duì)CtsR的結(jié)合親和力。重要的是，這種親和力的降低主要體現(xiàn)在解離速率的增加，表明了McsA的結(jié)合加速了磷酸化CtsR的離去速率從而加快了反應(yīng)循環(huán)。
此項(xiàng)工作首次解析了激酶復(fù)合物McsA-McsB的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，揭示了McsA通過鋅指結(jié)構(gòu)域及α螺旋與McsB結(jié)合，穩(wěn)定了McsB的關(guān)鍵催化半胱氨酸殘基C157并顯著降低了底物蛋白CtsR與McsB的結(jié)合能力，加速磷酸化CtsR的離去速率，從而增強(qiáng)McsB的精氨酸激酶活性，實(shí)現(xiàn)對(duì)CtsR的磷酸化修飾。這種磷酸化修飾通過McsA激活McsB后對(duì)CtsR的精準(zhǔn)調(diào)控，使得CtsR的抑制作用得以解除，從而迅速響應(yīng)環(huán)境變化，有效維持了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的質(zhì)量和功能穩(wěn)定。
相關(guān)研究成果于9月4日發(fā)表在Nature Chemical Biology期刊上?；瘜W(xué)院博士研究生盧開和陶璇以及四川大學(xué)華西醫(yī)院研究助理羅炳男為該論文的共同第一作者，四川大學(xué)華西醫(yī)院的蘇昭銘教授、中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院的夏煒教授和毛宗萬(wàn)教授為該論文的通訊作者。該研究工作受到了國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金和四川大學(xué)啟動(dòng)資金等項(xiàng)目的支持。
