中大新聞網(wǎng)訊（通訊員熊麗娜）人類基因組是由約30 億個字符組成的遺傳“密碼本”，決定細胞和個體發(fā)育的命運。該“密碼本”的98%字符都是具有“暗物質(zhì)”之稱的非編碼序列，而且約80%能夠轉(zhuǎn)錄成為 “暗物質(zhì)”核糖核酸（RNA）。這些“暗物質(zhì)”RNA大多數(shù)都是不具有帽子結(jié)構(gòu)的RNA（noncapped RNA，napRNA），且普遍作為非編碼RNA（ncRNA）在基因表達調(diào)控和疾病發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。然而，目前的研究主要集中于具有帽子結(jié)構(gòu)的RNA（capped RNA，capRNA）和短的napRNA，人們對長的napRNA（序列長度≥100核苷酸）的種類組成、結(jié)構(gòu)、生物生成及功能機制都知之甚少。
2024年3月18日，生命科學學院的楊建華/屈良鵠/李斌團隊在Nature Communications期刊上發(fā)表了題為“NAP-seq reveals multiple classes of structured noncoding RNAs with regulatory functions”的研究論文。該研究開發(fā)了NAP-seq測序技術(shù)和napSeeker算法，在單堿基精度鑒定具有各種末端修飾的napRNA的全長序列，發(fā)現(xiàn)多種新類型napRNA和成百上千的新結(jié)構(gòu)型ncRNA，解析它們在不同的細胞刺激和骨骼肌分化階段的動態(tài)變化圖譜，揭示了napRNA的表達、結(jié)構(gòu)特征、生物生成特性及其在細胞活動中的功能機制，為在各種生物中發(fā)現(xiàn)新的結(jié)構(gòu)型napRNA及其功能機制研究提供了新方法和新思路。
由于napRNA一般不具有polyA尾，因此傳統(tǒng)的利用PolyA富集的RNA-seq方法無法鑒定napRNA。即使是測定total RNA的RNA-seq方法，由于通過隨機六聚體引物對片段化的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄（RT）產(chǎn)生cDNA，也導致無法鑒定全長的napRNA序列和不能用于分類napRNA及不能用于確定其二級結(jié)構(gòu)等等。雖然通過小RNA測序（sRNA-seq）技術(shù)測定短napRNA發(fā)現(xiàn)了一些功能性小非編碼RNA（如：miRNA，piRNA），然而幾乎所有涉及sRNA-seq的研究都集中在小于50 核苷酸的napRNA，而不是各種長度和不同末端修飾的所有napRNA，尤其是長鏈（≥100 核苷酸）和結(jié)構(gòu)復雜的napRNA。針對這些問題，研究團隊開發(fā)了一種捕獲長鏈napRNA的全長序列的新測序方法—NAP-seq，具體的簡化步驟包括：對RNA樣品進行除雜、T4 PNK修復RNA末端、長度篩選、自主設(shè)計的3’端接頭和5’端接頭連接、非目標RNA的去除、巢式RT-PCR與預(yù)擴增、可選地片段化、在兩種不同的測序平臺（Oxford Nanopore三代單分子測序平臺和Illumina二代測序平臺）測序和開發(fā)新算法鑒定napRNA等步驟（圖1）。
圖1. NAP-seq的技術(shù)流程
研究團隊將NAP-seq技術(shù)應(yīng)用于多種人細胞系、細胞應(yīng)激和小鼠骨骼肌分化模型，在人類和小鼠中發(fā)現(xiàn)多種新類結(jié)構(gòu)型napRNA，包括穩(wěn)定表達的線性內(nèi)含子napRNA（sliRNA）、snoRNA-內(nèi)含子雜合napRNA（snotron）、嵌在miRNA間隔區(qū)的napRNA（misRNA），以及數(shù)千個新結(jié)構(gòu)型napRNA（圖2），并解析了這些napRNA可能的生物生成過程（biogenesis）。此外，研究團隊進一步聯(lián)合了NAP-seq和SHAPE-MaP等技術(shù)發(fā)展了NAP-SHAPE-MaP方法，解析了這些napRNA在體內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)。而且，通過RNA半衰期分析和表達分析發(fā)現(xiàn)，napRNA在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達并在不同的細胞刺激和分化階段發(fā)生動態(tài)變化，這提示napRNA可能具有調(diào)控功能。有趣的是，研究團隊還發(fā)現(xiàn)基因組的各種重復元件（repetitive element）可以轉(zhuǎn)錄和加工成多類新結(jié)構(gòu)型ncRNA（repRNA），包括box C/D，box H/ACA和聚合酶III轉(zhuǎn)錄的ncRNA。重要的是，NAP-seq鑒定到目前為止最長的新結(jié)構(gòu)型box C/D和H/ACA基因，展現(xiàn)出它能發(fā)掘各種長度napRNA的強大潛能。
研究團隊通過功能獲得、功能缺失和堿基突變等實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠骨骼肌分化過程中下調(diào)表達的一個新結(jié)構(gòu)型napRNA（mmu-novel-CD-6）具有抑制骨骼肌細胞分化的潛在調(diào)控功能。通過進化保守性分析和NAP-SHAPE-MaP結(jié)構(gòu)測序分析，研究團隊發(fā)現(xiàn)一個新的結(jié)構(gòu)型napRNA—DINAP，它是一個包含box C/D和box H/ACA結(jié)構(gòu)的雜合napRNA分子。DINAP從人到非洲爪蟾進化高度保守，提示DINAP可能行使重要的生物學功能。為了解析DINAP的生物學功能，研究團隊利用自主開發(fā)的starBase5平臺進行互作蛋白組分析并完成多個體內(nèi)實驗，發(fā)現(xiàn)和證實DINAP與假尿嘧啶合成酶DKC1相互作用。通過進一步利用放線菌酮追蹤實驗，發(fā)現(xiàn)DINAP與DKC1蛋白互作會影響DKC1蛋白的穩(wěn)定性。而且細胞表型實驗結(jié)果表明，DINAP通過維持DKC1蛋白的穩(wěn)定性來促進細胞增殖（圖2）。
綜上所述，這項研究工作通過開發(fā)多種新實驗策略和計算機算法以及結(jié)合二代測序（Illumina）和三代單分子測序（Nanopore）平臺實現(xiàn)了napRNA的全長測序（圖2），聯(lián)合團隊前期在Nature Biotechnology期刊發(fā)表的RIP-PEN-seq/PEN-seq技術(shù)，可以測定任何長度的napRNA和ncRNA。這些方法為探究現(xiàn)代“RNA世界”中的重要“新大陸(novel napRNA)”開辟了新途徑。
圖2. napRNA的系統(tǒng)發(fā)掘及功能機制研究
生命科學學院的楊建華教授、屈良鵠教授和李斌副教授為本文通訊作者，中山大學生命科學學院特聘副研究員劉樹榕和博士研究生黃鈞鴻為本文的共同第一作者；該研究得到實驗室其他成員的大力支持。中山大學生命科學學院為第一作者單位。本研究受到科技部重點研發(fā)項目、國家自然科學基金項目資助。
